réaction enzymatique: faire varier le pH

Pour des questions sur des TP qui ne trouvent pas de réponse.
magma
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réaction enzymatique: faire varier le pH

Messagepar magma » 14 déc. 2013, 19:01

Bonjour
Je compte faire un TP sur la recherche du pH optimum de l'amylase en fait de la mégamylase avec comme substrat l'amidon.
Méthode: toutes les 3mn prélever 1 mL du mélange amidon-amylase(35-37°), test sur plaque avec 3 gttes de Lugol.
Je veux faire varier le pH de 3 à 11, donc de 3 à 8 je vais utiliser un tampon phosphate-citrate, mais de 8 à 11 quel tampon utiliser?
Je comptais faire une solution d'amidon (8g/L) pour chaque pH, puis-je mettre l'amidon directement dans le tampon (bain-marie bouillant)?Cela me paraît plus logique que de mettre de l'amidon(dilution en ED) et de rajouter du tampon ce qui va modifier la concentration de l'amidon.
Je ne connais pas la plage du pH optimum de cette amylase.
Je vous remercie

marie-claude segui
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Re: réaction enzymatique: faire vaier le pH

Messagepar marie-claude segui » 14 déc. 2013, 20:33

Nous nous faisons beaucoup plus simple: empois d'amidon avec quelques gouttes d'HCL ou NaOH... et le pH varie de 1 à 11... pH optimum un peu plus de 7 je crois non?

magma
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Re: réaction enzymatique: faire vaier le pH

Messagepar magma » 14 déc. 2013, 23:32

Avant c'est ce que je faisais en 1ère, et je pense que montre une hydrolyse chimique et puis je crois que je n'ai utilisé que la liqueur de Fehling .
Je m'inspire du Belin p154, je me suis demandé pourquoi s'arrêter à pH 7. Dans le "Didier Pol" je viens de lire (p85) qu'il " ne faut pas dépasser un pH de 7,2 car l'iode ne se fixe plus sur l'amidon".
L' image du Belin me laisse perplexe, lorsqu'il n'y a pas d'amidon dans un composé on a la couleur du réactif: orange et non pas incolore.
Je ferai des tests lundi ou mardi.
Je vous remercie

magma
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Re: réaction enzymatique: faire vaier le pH

Messagepar magma » 16 déc. 2013, 21:12

Voici mes résultats pour ceux que cela intéresse. Tampon phosphate-citrate, l'amidon est directement mis en solution dans le tampon. Le dernier pH (9): Na2HPO4 utilisé seul.
https://www.dropbox.com/s/gbxg2gflzjj15l7/lugol_pH.jpg

cocotruc
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Re: réaction enzymatique: faire vaier le pH

Messagepar cocotruc » 17 déc. 2013, 09:59

Donc, vous avez utiliser de l'amidon à 8g/L ?
Et pour la méga-amylase, à quelle "concentration" ?
Merci de vos réponse, vos essais sont toujours très intéressants.
Corinne

magma
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Re: réaction enzymatique: faire vaier le pH

Messagepar magma » 17 déc. 2013, 12:54

Dans ce TP j'ai utilisé un nouveau flacon d'amidon, même prépa mais celui-ci n'est pas opalescent comme l'ancien; peut-être est-ce du à une origine différente. En tous les cas il est moins pâteux donc plus facile à pipeter.
Donc amidon:10g/L
Amylase: 1 cachet, lavé, broyé...(cf mon site) dans 200mL ED
Aujourd'hui.....tests T°

magma
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Re: réaction enzymatique: faire varier le pH

Messagepar magma » 17 déc. 2013, 21:44

Voici résultat pour température
https://www.dropbox.com/s/pfp45qy6q49ap9e/lugol-T%C2%B0.jpg
Même procédé
Précisions: 10mL amidon, 2 mL amylase comme le facteur précédent.
Pour chaque T°: 1 tube 10mL amidon + 1 tube 2mL amylase dans chaque condition pdt 3' puis transvasement de l'amylase dans amidon puis démarrage.
T° max : max du bain-marie, inutile puisque identique à 70°C


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