observation de mitochondries de levures

Pour des questions sur des TP qui ne trouvent pas de réponse.
Marc
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observation de mitochondries de levures

Messagepar Marc » 25 août 2013, 02:26

Bonjour M. Pol,

Je souhaiterais mettre en évidence la différence cytologique entre des levures en aérobiose et en anaérobiose, concernant l'abondance des mitochondries et leur activité. Le vert janus étant censé colorer en bleu les mitochondries respirant et en vert les mitochondries inactives de cellules fermentant, j'aimerais savoir après combien de temps de culture on peut espérer observer une différence de nombre et de couleur.

Pour l'instant, en tentant de colorer des levures fraiches, je n'ai rien obtenu de concluant : il y a bien des petites taches sombres qui pourraient être les mitochondries, mais elles sont présentes même sans le colorant, qui n'a pas d'autre effet notable que de colorer entièrement en bleu sombre une partie des cellules au bout de quelques heures.

Pol
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Re: observation de mitochondries de levures

Messagepar Pol » 26 août 2013, 12:15

Bonjour.
L'observation des mitochondries colorées par le Vert Janus est assez difficile : il faut réaliser l'observation le plus rapidement possible car la coloration est fugace après le montage.
Voici ci-dessous le protocole donné dans mon livre "Travaux pratiques de biologie des levures". Il faut préparer les cultures plusieurs heures à l'avance au minimum voire un jour ou deux et bien oxygéner la culture en aérobiose ainsi que le colorant.
Bien cordialement,
D. Pol

"Lorsque les levures respirent, chaque cellule contient une douzaine de mitochondries, organites responsables de la production d'ATP par respiration. En anaérobiose, les mitochondries perdent d’abord leurs crêtes caractéristiques puis disparaissent des cellules. Le vert Janus B colore électivement les mitochondries : il est maintenu à l’état oxydé bleu-vert par la cytochrome oxydase mitochondriale tandis que le cytosol reste incolore car le colorant y reste à l’état de leucodérivé réduit.
Protocole
1- Mettre en suspension 0.1 g de levure de boulangerie dans 100 mL de tampon phosphate pH 6.2 contenant 0.1 g de glucose.
2- Disposer dans la suspension un aérateur d'aquarium ou un ensemble de cathéters reliés à une pompe d'aquarium et laisser aérer pendant quelques heures.
3- Aérer avec le même type de dispositif la solution de colorant pendant une dizaine de minutes.
4- Mélanger une goutte de la suspension de levure avec une goutte de colorant et observer immédiatement sans mettre de lamelle (objectif x 40). Le cytoplasme présente des granulations bleu-vert correspondant aux mitochondries.
5- Si on désire observer à un grossissement plus élevé, il existe deux possibilités : soit placer une lamelle et observer immédiatement (dès que l'oxygène du milieu est épuisé la coloration disparaît), soit utiliser un objectif à immersion à eau (ne pas utiliser d'objectif à immersion à huile) directement sans lamelle."

Vert Janus pour coloration vitale
1- Dissoudre 1 g de glucose dans 100 mL d'eau distillée.
2- Dissoudre 5 mg de vert Janus B dans la solution de glucose précédente.
3- Faire buller de l’air dans la solution.


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